民國二十九年五月行政院公布「縣各級衛生組織大綱」，規定鄉鎮市(縣轄市)設立衛生所，是為設置鄉鎮衛生所最早之法源。民國三十四年為推動地方衛生事業，旋即展開設置衛生所計畫，本所於民國三十九年成立設於舊址高雄縣旗山鎮文中路4號。台灣省政府於民國四十一年四月二十三日公布「台灣省各縣(市)衛生機關組織規程」，規定鄉鎮市區(縣轄市)設立衛生所，隸屬縣市衛生院，兼受鄉鎮區市(縣轄市)長之督促，辦理各該轄境內之有關衛生保健事項，並得在村里設衛生室。
民國四十九年中央為加強地方自治實施公共衛生事務，將各縣市衛生院之編制擴大改制為衛生局，並於民國五十二年三月五日制定公布「台灣省各縣市鄉鎮區市(縣轄市)衛生所組織規程」，規定各鄉鎮市(縣轄市)衛生所隸屬於鄉鎮市公所(高雄縣旗山鎮公所)，業務兼受各該縣衛生局(高雄縣政府衛生局)之指揮監督，迄民國六十三年還隸屬於各縣市政府衛生局(高雄縣政府衛生局)。
鑒於本轄境內中寮里地處偏遠山區，交通不便，民國70年該里地方仕紳無償提供土地，並由台灣省政府撥款於該年6月27日興建衛生室(高雄縣旗山鎮中寮里中寮二路83之1號)，為該里推動衛生保健工作。
民國九十一年囿於本所辦公廳舍為加強磚造建築物，歷經五十二年廳舍老舊且空間狹小(佔地約150.66㎡)，建築使用面積約301.32㎡，雖經逐年整修硬體設施仍無法完全因應現代民眾服務需求，且限於基地使用權限制，無法原址改建，故經高雄縣政府衛生局、旗山鎮公所及高雄縣政府社會局協調另覓地重建，民國九十三年元月份於現址竣工，並於該年三月份落成啟用，現址占地面積1002.61㎡，為地上三層地下一層建築物，建築總面積1644.8㎡，格局方正，規劃完善。
民九十九年十二月二十五日高雄縣市合併升格改制直轄市，本所改隸屬高雄市政府衛生局，擴大衛生所服務項目，並提升衛生所推動公共衛生工作效能。